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HBV基因定量分析技术的应用价值、存在问题及展望--HBV基因定量分析技术的应用价值

兴瑞范文网 http://www.lanyuan.org.cn 2020-01-13 18:45 出处:网络 编辑:













作者:缪晓辉 孔。宪涛







    近年来HBV基因定量。分析的价值受到越来越多研究者的。重视[1]。过去由于过分强调了HBV感染后过强的细胞免疫应答介导肝细胞损伤,忽视了对病毒复制水平与致病性之间因果关系的研究。目前普遍认为,尽管H。BV不直接破坏寄生细胞,但病毒的活跃复制是启动或激发肝脏组织炎症反应的因素。这表明确定感染者体内HBV复制状态,即从HBV基因定。量的角度作病情分析是十分有意义的。事实上,真正引起人们关注HBV基因定量分析价值的重要原因是最近发现了干扰素治疗与HBV基因水平两者之间有非常密切的关系。HBV基因定量分析还在转基因动物、基。因治疗、蛋白疫苗和核酸疫苗、抗HBV药物体外试验和动物试验及耐药研究、流行病学研究、HBV血液制品污染监测等方面具有重要的应用价值。







一、HBV基因定量分析在干扰素治疗中的应用





    尚无药物可以清除所有HBV感染者体内HBV颗粒。干扰素是目前唯一。有一定疗效的一类生物制剂[2],它在病。毒等诱导下由几种相关细胞产生,并。发。挥抗病。毒作用。但是无论使用何种干扰素,也无论治疗剂量或疗程如何,干扰素治疗后HBV转阴率迄今仍保持在40%左右,无法进一步提高,究竟有哪些制约因素起作用尚无定论。





    近年来发现干扰素的治疗效果,即干扰素治疗后的反应性(response)很大程度上取决于HBV在体内的复制水平[2,3]。以下几点事实值得注意:⑴治疗前HBV低水平复制者的反应性明显优于高水平复制者。HBV转阴的几乎都是那些治疗。前血清HBV DNA。含量较低者,而治疗前HB。V DNA含量。特别高者大多没有疗效;⑵治疗中病毒复制水平迅速降低者,有望治愈。相反,治疗期间H。BV基因水平下降较慢,或下降幅度较小,或变化不明显者,大多。是无效者;⑶治疗结束后,采用PCR定量法检测,HBV DNA完全转阴者可能不再复发,而终止治疗后HBV DNA仍。保持较低水平者,反跳的可能性较大。可见,使用干扰素治疗HBV感染时,在各种近期和远期疗效指标中,除了病人的临床表现是否好转,生化指标(ALT)是否改善,肝组织炎症反应是否减轻等以外,血清HBV DNA定量分析是一个十分重要的观察项目。从现有研究资料看,除病理检。查外,HBV DNA定量检。测,也许是干扰素治疗效果判断依据中最直接、最可靠和最有价值的指标。多数研究者认为,通过HBV DNA定量分析来指导干扰素治疗,有重大意义。首先,在治疗对象的选择方面,即确。定干扰素治疗适应症时,应对各侯选病例在某个时间段内定期反复检? ?BV DNA水平,那些长期保持HBV高复制水平者不宜接受干扰并素治。疗,或应当联合治疗;其次,干扰素治疗期间,可根据。HBV基因水平的动态变化适。时调整治疗剂量,决定是否缩短或延。长疗程,及是否终止治疗。这不仅对制订合理的治疗方案,也对减轻病人负担,避免不恰当用药有指导意义[4]。笔者认为,目前国际上普遍采用的所谓“六个月疗程”及某些中高剂量治疗方案均缺乏。充分和足够的立论依据,有必要结合基因定量分析结果,重新评价和制订干扰素治疗计划;最后,干扰素治疗结束后,对有反应者。定期作定量分析,有助于发现复发者,并根据血清HBV DNA含量波动情况决定是否实施再治疗。有人报告,首次干扰素治疗有效者,再治疗的效果亦佳。如果第一次治疗无反应或反应较差者,第二次干扰素治疗仍不能取得理想疗效[5]。





二、HBV基。因定量分析的其他临床价值





    HBV感染后,在临床表现方面的差异非常明显,可以表现为无症状携带者、急性肝炎、慢性肝炎、暴发型肝炎、肝硬化及肝癌等多种疾病状态。病毒在肝细胞内的复制水平与各种临床疾病状态之间可能。存在着某些必然联系。由于HBV基因定量技术。的发展和成熟,目前已有可能。从某些现象上阐明HBV复制与致病性之间的“量效”关系。





㈠“无症状携带者”可。能为活动性乙肝患者[6。]。有部分HBV感染者,由于免疫耐受或其它原因,体内HBV呈复制不活跃的“。潜伏”状态,但并不意味着不存在进行性肝损害。Mels等研究发现无症状携带者在其自然发展史上,HBV复制处于波动状态,时有加剧,病毒复制积累到。一定程度。后ALT水平增加。一般规律是:血清HBV DNA水平上升® ALT活性增加® IgM。抗HBc滴度提高。因此无症状携带者应采取积极治疗。措施,否则这类人群不仅作为重要的病毒库传播HBV,而且由于隐匿性。肝细胞损伤的不断积累,不经过慢性肝炎阶段,直接向肝硬化和肝癌发展。





㈡HBV DNA水平与HB。V感染者病情和预后的关系密切。上述无症状携带者是一个特殊群体。而对那些急性和慢性乙型肝炎患者而言,HBV DNA水平对预后判断有帮助。研究发现HBV DNA一直保持较高水平的急性肝炎患者易慢性化,而HBV复制水平较高的慢性肝炎患者不仅对干扰素治疗的反应性差,而且肝组织炎症反应更明显,病情更重,更易发生肝硬化和肝癌。目前在能否用血清HBV DNA水平来判断肝组织炎症损伤程度这类问题上尚有争议。动物实验表明,鸭肝被DHBV广泛感染的同时,并不伴随明显病毒血症,肝细胞清除病毒的同时也无病毒血症加重的证据[7]。然而最近有人对HCV感染者进行基因定。量分析研究,发现HCV RNA水平与ALT水平以及肝脏kno。dell分级之间有密切关系[8]。





㈢肝移植者HBV DNA定量的意义





    M。azza。ferro等报告肝移植前患者血清HBV DNA水平的高低决定移植后肝脏是否再感染HBV[9]。作者观察到,14例移植前血清HBV DNA含量低于103拷贝/ml,移植后不间断地采用HB。sAb免疫预防,随访36个月,无一例再发肝炎,但另外两例移植前病毒拷贝数大于105/ml则发生了严重HBV再感染。建议移植前使用抗HBV药物,最大限度降低血清。HB。V DNA浓度,有助于防止HBV侵犯移植后肝脏,提高肝脏移植的效果。





㈣。前。核基。因突变HBV定量意义





    HBV前核基因突变可导致HBeAg表达缺失。感染不表达HBeAg的HBV突变株,或野生型HBV在体内突变并成为优势株均产生较严重的后果,如易发生暴发性肝炎,预后差,干扰素治疗无效等[9,10]。目前已能采用核酸序列测定技术、PCR技术、限制性片段。长度多态性(RFLP)分析技术等来定性检测HBV前核基因突变。最近Baxall建立了一种PC。R及产物的显色反应点突变分析技术(Colourimetric point mutation assay),用来定量分析突变前核基因,有助于进一步探讨HBV突变与致病性之间的关系[11]。





    。基因。定量分析是一项临床应用型技术,但对基础研究也有一定的应用价值[12],尤其是在当前基因治疗、转基因动物、核酸疫苗等热点研究领域,基因定量分析可能是一种很好的辅助手段,对发现一些有意义的现象也许有一定帮助。比如HBV在转基因小鼠组。织脏器分布规律可用定量标准来衡量,以及用定量手段观察各种药物、细胞因子和其它物质对转基因小鼠HBV基因复。制的调节作用。又如对核酸疫苗注入肌组织。后的各种动力学变化的研究远未深入,如能采用定量手段,分析抗原表达基因在体内的存在状态无疑是有益的。至于各种抗HBV药物,无论是在体外细胞模型(包括转基因细胞模型)还是在动物模型的研究,或在人体研究,采用基因定量分析,应当是。考核药物疗效的最佳手段[13]。





HBV因。定量分析存在的问题及未来展望





    HBV基因定量技术的发展历史不长,但由于有定性技术为基础,以及与其它学科方法的融汇,发展速度很快,目前趋于成熟。但。应用定量技术去研究HBV感染的临床问题还不充分,同时定量技术本身也有许多问题。值。得探讨。





一、国际标准化。这是一个最为突出而又必须尽快解决的问题。欧洲有一个“病毒性肝。炎研究组”(European Study Group in Viral Hepatitis),经常向欧洲的某些研究机构提供HBV血浆标准品作定量分析参考[。14]。有必要在国际上设立统一的HBV基因标准品,包括各种HBV亚型的标准参照。笔者认为,克隆的HBV 。DNA质粒不。适宜作标准品。克隆HBV 。DNA与载体构成了闭环超螺旋结构,而且,一级结构单一,这与体内存在的HBV基因。结构差异很大。后者呈部分双链,在血清中尚有裂解片段及复制中间体等形式。因此,无论是在分子杂交,还是在PCR过程中,质粒HBV DNA结构与人体内感染的HBV DNA结构在杂交。效率或扩增效率上必然有细微差别,结果将影响定量分析的准确性。如从高水平HBV阳性病人血清大量抽提,或从转基动物血液中纯。化得到HBV DNA,可能是一个制备标准品的途径。总之,国际化的标准参照,是保证HBV DNA定量技术精确性和可靠性的前提。





二、分子杂交定量技术和PCR定量技术应当共存下去吗? 以下两点值得考虑:首先,有必要弄清体内HBV复制水平极低者(如低于1fg/ml)占HBV感染人数的比例有多大?这类低水平复制者预后如何?如果这类人群属于急性感染恢复期,或有。自然清除病毒倾向者,那么似无。必要作常规PCR定量分析,定期进行PCR定性检测即可。其次,有必要建立一种敏感度介于分子杂交和P。CR定量技术之间的检。测系统。最近有人利用电化学技术观察到DN。A双链互补杂交,甚至单个碱基对。结合时发生了微电反应,这给我们以很大启示,今后如有可能在这方面打开突破口,那么基因定量分析两大技术共存的局面会发生转变。但是,在目前。这两大技术仍有很强的互补性。





三、HBV突变株定量分析意。义的研究。HBV基因突变[15],尤其是前核基因突变,直接。影响H。BV感染病情转归及抗毒治疗效果,同时也反映了来自体内或外界选择压力的作用。因此,突变株在体内产生的确切原因,突变株与野生株混合存在的发展趋向,突变株是否为耐药株,突变株与野生株相对含量的变化与致病性的关系,突变株与免疫耐受的。关系。等均是有必。要进一步澄清的问题。





四、基因定量技术在HBV感染流行病学方面的应用[16]。HBV经血液传播致病已十分明确,但是体液传播的问题还。必须有充足的。证据来补充。体液及其它分泌液或排泄物传播HBV是日常生活密切接后感染HBV的直接原因,但其中必。然存在“含量与传染性”的关系,那么这个致病的量值完全可以通过HBV感染流行病学研究得到确证。另外,被污染血制品中HBV基因含量与使用血制品后感染HBV的危险性之间的关系也值得研究。





五、加强HBV低水平复制者预后研究。目前。看来,所谓健康携带者或无症状带病毒者、干扰素治疗部分反。应者(partial responders),以及其他种种HBV在体内呈低复制状态者,在。病情、机体免疫状态、预后等方面可能都有。一些特殊性,这类病人是否有自然清除病毒的倾向,是否。应当。实施抗病毒治疗,是否成为重要的传染源等问题都应该作出符合实。际的回答。





六、HBV复制水平与抗病毒药物疗效之间的关系研究有待深入。笔者认为,HBV 。DNA水平。与干扰素治疗效果之间的所谓联系在理论上缺乏根据,可能是一种表面现象,有必要探讨其本。质。病毒复制水平高低取决于病毒自身的生物活性和机体的。免疫功能,应当从病毒和机体两方面寻找突破口,提高干扰素抗HBV的效果。





    最后,在中国,有世界上为数最众的HBV。感染及相关慢性肝病患者,但我们在HBV感染诊治研究方面仍处于落后状。态。就HBV定量技术而言,目前尚未建立分子杂交。定量分析技术,现。已报。告的PCR定量分析法也属于。低水平重复,今后有必要重视这方面的投资和开发。在临床研究。领域应当有自己的立足点,不应简单重。复国外研究结果。就HBV DNA定量分析意义的研究而言,简单重复的现象已不鲜见,必须引以。为戒。                             。                 





参考文献





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